陈 乐¹，苗则彦¹，孙柏欣¹，赵杨¹，段玉玺²，白元俊³

(1.辽宁省农业科学院植物保护研究所；2.沈阳农业大学北方线虫研究所；3.辽宁省农业科学院水稻作物研究所)

　　由半知菌亚门葡萄属的灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers.ex.Fr.）引起的灰霉病是重要的世界性病害之一。该菌寄主广泛，可侵染蔬菜、水果、花卉等240余种植物，且在采后的贮藏和运输过程中均可发生，造成严重的经济损失。由于缺少抗灰霉病的作物种质资源及生物防治的局限性，化学药剂是防控灰霉病最有效的途径。

　　农业生产中最早使用的化学防治药剂为多位点杀菌剂。用于灰霉病防治的多位点杀菌剂有百菌清、克菌丹、抑菌灵、福美双等。多位点杀菌剂一般为保护性杀菌剂，在实际应用中较难产生抗性，但防治效果相对较差，且因仅具有预防作用需要较高的施用频率和施药量，在一些国家或地区已经停止使用。目前，国内外生产中常用的防治灰霉病杀菌剂多为单一活性位点杀菌剂，在低剂量时表现出很高的杀菌活性，包括苯并咪唑类杀菌剂（MBCs）、二甲酰亚胺类杀菌剂（DCFs）、N-苯胺基甲酸酯类（NPCs）、苯胺基嘧啶类、苯吡咯类、吡啶胺类、琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHIs）、甲氧基丙烯酸酯类（QoIs）和甾醇生物合成抑制剂类（SBIs）。据统计，防治葡萄孢属病害的杀菌剂约占全球杀菌剂市场的8%。

　　单一活性位点杀菌剂的高活性也增加了抗药性的风险，加之灰霉病具有繁殖速度快、产孢量大、遗传变异大和适合度高等特点，以及农户对病害发生规律、科学用药等相关知识的欠缺，导致盲目加大药剂用量或混乱用药，使得多种药剂出现了不同程度的抗药性，甚至多重抗药性。灰霉病的抗药性问题给生态环境和农产品质量安全带来重大隐患。本文概述9类常用灰霉病杀菌剂的作用原理及抗性分子机制的研究进展，以期为抗药性管理提供必要的理论依据。

1  单一活性位点杀菌剂作用机制及灰霉病菌对其抗性机制

1.1   苯并咪唑类杀菌剂

　　苯并咪唑类杀菌剂（methyl benzimidazole carbamate，MBCs）为细胞骨架抑制剂，作用位点是β-微管蛋白，代表品种为多菌灵、苯菌灵和甲基硫菌灵等。细胞骨架抑制剂通过与微管蛋白结合，进而影响细胞分裂、有丝分裂和蛋白质分泌，以达到杀菌目的。灰霉病病菌对该类杀菌剂的抗药性主要由β-微管蛋白基因的单点突变造成，突变位点位于第198位谷氨酸（E198A/G/K/V）和200位苯丙氨酸（F200Y）（表1）。

表1  灰霉病杀菌剂的作用模式及抗性机制

注：目标基因位点与bik基因接近

　　1971年Bollen等首次在荷兰温室的仙客来上发现对苯菌灵的抗性菌株。我国在1987年首次发现对苯并咪唑类杀菌剂的抗性菌株。周明国等在南京市郊大葱上分离到对多菌灵的高抗灰霉菌株，之后北京、上海、四川、山西等地相继检测到对苯并咪唑类杀菌剂的抗性菌株。在葡萄孢属的其他真菌（B.alii、B.ovaltica和B.tulipae）中也检测到对苯并咪唑类杀菌剂的抗性菌株。抗药性的产生导致杀菌剂的药效降低，以及具有更高内在活性杀菌剂的发展，苯并咪唑类杀菌剂现在几乎没有使用。

1.2  二甲酰亚胺类杀菌剂

　　二甲酰亚胺类杀菌剂是天然抗真菌化合物吡咯硝啉的结构类似物，于20世纪70年代初开始使用。该类杀菌剂作用于真菌的双组分组氨酸激酶信号途径，虽然其精确作用机制尚不清楚，但可引起灰霉病菌的甘油积累，膜质过氧化和质膜渗透，进而抑制灰霉病菌的分生孢子萌发、菌丝生长和毒素产生。生产上常用的二甲酰亚胺类杀菌剂有腐霉利和异菌脲，灰霉病菌对二甲酰亚胺类杀菌剂各品种之间存在正交互抗药性。由于广泛使用，二甲酰亚胺类杀菌剂在B.cinerea种群中迅速产生了选择性和抗药性，田间抗性菌株大都是低等到中等抗性，高抗菌株经人工驯化也能分离得到，但均表现为适合度低下。在加拿大的洋葱鳞茎（B.squamosa）和鲜花鳞茎（B.elliptica）也发现了二甲酰亚胺类杀菌剂的抗性菌株。

　　我国先后在天津、山东、江苏、广西、浙江、辽宁、吉林、河北、湖南、山西、北京、安徽、福建、上海和内蒙古检测到腐霉利的抗性菌株，且抗性频率普遍较高；在浙江、北京、江苏、湖南、山东和辽宁检测到异菌脲的抗性菌株。随着分子技术的发展，许多学者证实双组分组氨酸激酶BcOS-1基因上的点突变I365N/R/S、V368F、Q369P、N373S、T447S与二甲酰亚胺类药剂抗性有关。

1.3  N-苯基氨基甲酸酯类

　　N-苯胺基甲酸酯类杀菌剂乙霉威和苯并咪唑类杀菌剂具有相似的作用模式，均为细胞骨架抑制剂，作用位点是β-微管蛋白。乙霉威与多菌灵呈负交互抗药性，可用来防治对多菌灵产生抗性的灰霉病菌。但在使用几年后，在新西兰、意大利、以色列、英国等地陆续发现了多菌灵和乙霉威的双抗灰霉菌株。我国生产的乙霉威与苯并咪唑类杀菌剂的复配药剂多霉灵、甲霉灵等在连续使用几年以后，发现其田间防效明显降低，出现了Ben^RNP^C菌株。

　　灰霉病病菌对两类杀菌剂的抗性菌株主要有两种表型：第一种表型是对苯并咪唑类杀菌剂高抗的菌株对N-苯基氨基甲酸酯类杀菌剂敏感（Ben^HR，NPC^S）；第二种表型是对这两类杀菌剂呈交互抗药性（Ben^HR/MR，NPC^R）。这两种表型都是由β-微管蛋白的编码基因benA（tubA/btuB/mcb同义突变）点突变产生。E198A/V突变在Ben^HRNPC^S表型中检测到，而E198K/L或F200Y突变在Ben^HR/MRNPC^R菌株中检测。即便在没有杀菌剂选择压力的情况下，E198A突变体也广泛分布于灰霉病病菌种群中。这与携带F200Y突变基因的灰霉病病菌形成鲜明对比，当多菌灵与乙霉威混剂停止使用时，F200Y突变的频率迅速下降。

1.4  苯胺基嘧啶类杀菌剂

　　苯胺基嘧啶类杀菌剂是继苯并咪唑类、二甲酰亚胺类和氨基甲酸酯类之后防治灰霉病的一类高效杀菌剂，包括嘧菌环胺、嘧霉胺和嘧菌胺等。苯胺基嘧啶类杀菌剂的一个作用机制是抑制甲硫氨酸的合成。然而，Fritz等研究表明，嘧霉胺对胱硫醚-β-裂解酶的活性无任何影响，在抗性菌株bcmetC基因序列无特定的突变产生，在编码参与甲硫氨酸合成的胱硫醚-γ-裂解酶、胱硫醚-γ-合成酶和胱硫醚-β-裂解酶基因也无突变产生。另一个可能的作用机制是抑制病菌胞外蛋白酶的分泌。目前，苯胺基嘧啶类杀菌剂的直接作用靶标尚不清楚。

　　在引入苯胺基嘧啶类杀菌剂数年后，发现了对这类杀菌剂的中抗或高抗菌株。目前，在灰霉病病菌种群中普遍存在对苯胺基嘧啶类杀菌剂的抗性。2002年纪明山等发现，辽宁省番茄灰霉病病菌对嘧霉胺产生了抗药性，抗性水平中等。2008年赵琳等再次检测了辽宁省番茄灰霉病对嘧霉胺的抗药性，分离到6株高抗菌株。近两年，辽宁省番茄灰霉病病菌已经普遍对嘧霉胺产生了抗药性，且均为中、高水平抗性。遗传分析研究表明，在无选择压力的情况下，灰霉病病菌在营养生长过程中对苯胺基嘧啶类杀菌剂的抗性具有很强的不稳定性，说明抗性菌株是异核体。这个观点通过抗苯胺基嘧啶类杀菌剂同核体子囊孢子的致病力得到证实。

1.5  苯基吡咯类杀菌剂

　　苯基吡咯类杀菌剂咯菌腈的作用机制与二甲酰亚胺类杀菌剂类似，通过干扰真菌的双组分组氨酸激酶信号途径来发挥作用，但其精确作用位点尚不清楚。咯菌腈并不真正存在抗药性问题，这是由于咯菌腈抗性突变体的适合度降低。对咯菌腈抗性突变体进行分析，发现其分生孢子产生率和致病性降低，对渗透性和其他压力的敏感性增加。

　　研究表明，组氨酸激酶基因bos1突变可产生咯菌腈抗性突变体。Bos1蛋白接收杀菌剂信号，并将信号传递给下游的MAP-激酶BcSak1，进而刺激细胞导致细胞壁分解、细胞膨胀和破裂。2011年欧洲的草莓和葡萄上分别分离到了咯菌腈中抗和低抗菌株。Li等在美国北卡罗来纳州、南卡罗来纳州和弗吉尼亚州的草莓和蓝莓上分离到咯菌腈低抗和中抗灰霉菌株。Ren等首次在我国山东省寿光市和潍坊市分离到咯菌腈高抗菌株，基因分析表明，田间高抗菌株的突变发生在Bos1基因的组氨酸激酶、腺苷酸环化酶、接受甲基趋化性蛋白、N端的HAMP结构域，而实验室诱导产生的高抗菌株突变发生在HAMP结构域或羧基端的HATPase_c结构域。

1.6  吡啶胺类杀菌剂

　　解偶联剂能够降低线粒体膜上的质子梯度，从而减少甚至抑制ATP合成。外源解偶联剂通常是带有游离负电荷的疏水化合物，能够穿透线粒体膜。唯一归类为解偶联剂的杀菌剂是吡啶胺类杀菌剂氟啶胺，其作用方式是氧化磷酸化。氟啶胺具有广谱的预防作用，作为解偶联剂参与质子化和去质子化反应。

　　氟啶胺也作用于线粒体呼吸作用，如抑制硫醇基团，释放细胞色素c到细胞质中，抑制线粒体电子传递链（ETC）的复合物I。这些对真菌呼吸作用的多重活性解释了氟啶胺杀菌谱的广谱性，同时也解释了迄今为止几乎没有关于氟啶胺抗性菌株的报道。目前，仅有日本氟啶胺野生抗性菌株的报道。氟啶胺在国外广泛用于防治灰葡萄孢引起的灰霉病，而在国内仅登记防治马铃薯晚疫病、十字花科蔬菜根肿病，尚未登记防治灰霉病。我国山东、河北、福建和江苏已经建立氟啶胺的敏感基线。Shao等实验室诱导产生的氟啶胺抗性菌株致病力和产孢量明显降低，对渗透压力高度敏感，且与咯菌腈、腐霉利存在交互抗药性，其具体抗性机制尚不明确。

1.7  甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂

　　杀菌剂的另一个重要作用靶标是真菌的呼吸作用和能量代谢。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂（quinone outside inhibitors，QoIs）由担子菌（如Strobilurus ten-acellus）次级代谢产物嗜球果伞素A（strobilutin A）衍生而来，于1992年引入市场，包括嘧菌酯和肟菌酯等。它们与真菌细胞内的细胞色素b（线粒体呼吸传递链的复合物III）Qo位点结合，阻止电子由复合物III向复合物IV传递，抑制NADH氧化和ATP合成。事实上，由于交替氧化酶（AOX）的组成表达，QoIs对灰霉病病菌具有很低的内在活性，AOX允许电子绕过杀菌剂结合位点而继续传递。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂具有很高的抗性风险，其靶标位点由线粒体cytb基因编码，抗性能够通过母体传递，也能通过菌丝融合传递。大多数植物致病真菌在使用甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂后都会产生抗药性。这是由于cytb基因G143A、F129L及G137R突变产生，带有G143A突变的菌株表现为高抗，而带有F129L和G137R突变的菌株表现为中抗。

　　灰霉病病菌cytb基因含有不同种类的内含子（Bcbi-67/68、Bcbi-131/132、Bcbi-143/144、Bcbi-164），嘧菌酯抗性菌株均不含内含子Bcbi-143/144、Bcbi-143/144与QoIs抗性的发展息息相关。即使未使用QoIs来防治葡萄孢属病害，这种抗药性也普遍存在，说明通过QoIs防治其他病害也可以使葡萄孢属产生抗药性。我国江苏、浙江、上海、四川、湖北、北京、河北、辽宁均有QoIs抗性菌株的报道。一种新型QoIs杀菌剂-苯基氨基甲酸酯杀菌剂吡菌苯威，因为与传统QoIs存在负交互抗药性而对QoI抗性菌株有特效，相较于其他QoIs，吡菌苯威在细胞色素b内的结合位点略有不同。

1.8  琥珀酸脱氢酶抑制剂

　　琥珀酸脱氢酶抑制剂（succinate dehydrogenase inhibitors，SDHIs）作用于线粒体呼吸传递链的复合物Ⅱ。在线粒体基质中琥珀酸脱氢酶将琥珀酸氧化成延胡索酸，在线粒体内膜中将泛醌还原。琥珀酸脱氢酶是由4种核基因编码的蛋白质组成的复合体（SdhA、SdhB、SdhC、SdhD）。琥珀酸脱氢酶抑制剂与泛醌结合位点（Q-位点）的保守端形成氢键，通过杂环原子与疏水基团或π互作，参与胺基的芳香族循环。根据分子结构可将SDHIs分为6类：苯甲酰胺类（氟吡菌酰胺、氟酰胺），呋喃酰胺类（甲呋酰胺），氧硫酰胺类（萎锈灵、氧化萎锈灵），吡唑酰胺类（联苯吡菌胺、吡唑萘菌胺、吡噻菌胺），吡啶酰胺类（啶酰菌胺），噻唑酰胺（噻氟菌胺）。苯甲酰胺类根据胺基结构不同也可分为两类：苯基苯甲酰胺（氟菌胺）和吡啶乙基苯甲酰胺类（氟吡菌酰胺）。其中啶酰菌胺（2002年）、吡噻菌胺（2009年）、吡唑萘菌胺（2010年）和氟吡菌酰胺（2012年）是最新登记注册用于葡萄孢属真菌的防治。

　　采自不同地区不同寄主的灰葡萄孢对啶酰菌胺的敏感基线已经建立，Stammler首次报道对啶酰菌胺的抗性菌株，之后在许多国家的不同作物上陆续有抗性菌株的报道。我国山西、山东、河北、上海、浙江辽宁相继有啶酰菌胺抗性菌株的报道。2012年氟吡菌酰胺在我国登记注册。张晓柯等建立了江苏省草莓灰霉病病菌对氟吡菌酰胺的敏感基线。武文帅等从上海市不同地区采集的灰霉病病菌中有20%对氟吡菌酰胺表现高抗。SDHIs抗性菌株突变位点发生在琥珀酸脱氢酶B亚基和D亚基的编码基因上，即sdhB和sdhD，特别是泛醌结合位点SdhBP225和SdhBH272，亚铁血红素结合位点SdhDH132，以及SdhB亚基的N230I突变。尽管在草莓上分离到的抗性菌株检测到了SdhC亚基的改变，但无证据显示与啶酰菌胺及氟吡菌酰胺的抗性相关。

　　SdhBP225F/L和SdhBH272L/V在所有突变类型中抗性水平最高。基因型分析表明SdhB亚基的所有突变类型均与啶酰菌胺抗性相关，其中SdhBH272R和SdhBH272Y发生频率最高。所有SdhB突变类型对吡啶酰胺类杀菌剂均有不同程度的抗性，与氟吡菌酰胺、氧硫酰胺类和其他琥珀酸脱氢酶抑制剂也有不同范围的交互抗药性。研究表明，sdhB突变与SDHIs对琥珀酸脱氢酶亚基的亲和力相关，其中H272、P225和N230位点与酰胺基结合密切相关。sdhBH272Y突变导致氟吡菌酰胺抗性升高，但对琥珀酸脱氢酶活性和呼吸作用无影响，这类抗性突变体是目前分离率最高的突变类型。无论是野生突变株还是室内定向诱导突变株，SDHIs抗性与适合度代价相关。竞争性实验结果表明在不同SDHIs选择压力下，抗、感菌株出现了明显分化，氟吡菌酰胺导致sdhBP225F突变型占主导地位。

　　啶酰菌胺与氟吡菌酰胺（或将来其他SDHIs杀菌剂）混合使用可能改变抗性群体的结构，这些已知或新的sdh等位基因在所有琥珀酸脱氢酶抑制剂之间具有很强的交互抗药性。为了评估SDHIs选择压力变化对抗性发展的影响，有必要采用生物分析和分子技术相结合的手段进行持续监测。

1.9  甾醇生物合成抑制剂

　　麦角甾醇是真菌特有的物质，主要存在于真菌的细胞膜中。因此，麦角甾醇的生物合成是杀菌剂的重要靶点。用于防治灰霉病的甾醇生物合成抑制剂主要有C4-脱甲基抑制剂（环酰菌胺）及C14 α-脱甲基抑制剂（戊唑醇、咪鲜胺和啶菌噁唑）。C4-脱甲基抑制剂的作用范围局限于葡萄孢属及其亲缘物种，但B.pseudocinerea对环酰菌胺存在天然抗性。

　　环酰菌胺抑制C4-脱甲基化过程的甾醇3-酮还原酶（Erg27），阻止麦角甾醇的合成，导致有毒中间物质的积累。遗传分析表明，对环酰菌胺的抗性是由于目标位点改变，高抗菌株在Erg27蛋白的412位苯丙氨酸位点发生替换，而中等抗性菌株发现了20个单一位点改变。这些改变降低了环酰菌胺对3-酮还原酶的亲和力，使该酶在高浓度环酰菌胺条件下依然保持活性。环酰菌胺尚未在我国登记使用，尹大芳等研究表明，灰霉病病菌存在低比例的环酰菌胺自然抗性菌株，首次发现S9G、P57A、P269L、V365A、E368D、E375K和A378T7个突变位点。Zhang等在浙江和江苏的灰霉菌株中发现了环酰菌胺的抗性菌株，抗性频率为10%。

　　啶菌噁唑是沈阳化工研究院自主研发的同时具有保护作用与治疗作用的杀菌剂。马建英等采用菌丝生长速率法测定河北省不同地区灰霉病病菌对啶菌噁唑的敏感性，EC₅₀值在0.069 3～3.057 8 μg/mL，与嘧霉胺、腐霉利、多菌灵和苯醚甲环唑无交互抗药性。Zhu等检测辽宁省10个区（市）番茄灰霉病病菌对啶菌噁唑的敏感性，其平均EC₅₀值为（0.067 6±0.040 9） μg/mL。目前无抗性菌株的相关研究报道。

2  与作用位点无关的灰霉病病菌抗性机制

2.1  多重抗药性

　　自20世纪90年代以来，在法国葡萄园中发现了对几种杀菌剂表现出单一主效基因低到中等抗性的B.cinerea分离株，是由于不同分子结构杀菌剂的选择压力所致。已研究的多重抗药性（Multi-drug resistance，MDR）有3种模式，即MDR1、MDR2和MDR3。MDR1菌株表现出对咯菌腈、嘧菌环胺和托萘脂的抗性增强，MDR2菌株表现出对环酰菌胺、托萘脂、放线菌酮和嘧菌环胺的抗性增强，MDR3显示出比MDR1和MDR2更高水平和更广谱的抗药性。

　　多重抗药性涉及ABC（ATP-binding cassette）转运因子或MFS转运因子的上调。在B.cinerea多重抗药性菌株中，杀菌剂外排也发挥作用，这与膜运转因子的超表达相关。MDR1表型是由于转录因子Mrr1点突变引起的ABC转运蛋白基因atrB超表达，但MDR2表型是由于MFS家族转运蛋基因MFSM2启动子区插入了一段1 326 bp外源片段，并引起MFSM2启动子区678 bp片段丢失，导致MFSM2发生超表达。MDR3表型来源于mdr突变重组，可能发生在有性生殖之后。Walker等在葡萄园中收集到的灰霉病病菌株中60%以上表现出MDR表型，每种表型约占20%。草莓上分离的B.cinerea含有一种新型MDR1，命名为MDR1h，其对嘧菌环胺和咯菌腈的抗性水平是MDR1菌株的2～3倍。Mrr1基因（ΔL497）3 bp缺失导致atrB基因150～300倍超表达，高于MDR1菌株3～6倍。

2.2  解毒作用

　　通过谷胱甘肽-s-转移酶（GSTs）、细胞色素P450酶、水解酶或酯酶等促进有毒化学物质代谢，是一种广泛存在于害虫和杂草中的抗药机制。解毒作用使不同作用方式的农药产生交互抗药性，如MDR。在植物病原真菌中，这种机制很少产生杀菌剂抗性。Leroux认为，解毒可能是多位点杀菌剂和氟啶胺的抗性机制，但迄今为止，只发现极少数对这些杀菌剂具有抗性的田间分离株。葡萄属新物种B.pseudocinerea对环酰菌胺的天然抗性可能与解毒作用相关。与B.cinerea相比，环酰菌胺对B.pseudocinerea目标酶亲和力降低。Leroux等观察到环酰菌胺和DMIs对B.pseudocinerea的菌丝生长具有协同作用。Billard等发现了一种细胞色素P450与DMI靶标Cyp51相似，命名为Cyp684，Cyp684失活使B.pseudocinerea完全失去了对环酰菌胺的抗性。环酰菌胺处理后，B.pseudocinerea的cyp684表达水平高于B.cinerea菌株，但代谢产物仍不清楚。至今仅发现一个抗环酰菌胺的B.cinerea菌株，即HydR2，抗性机制与解毒作用相关。

3  灰霉病病菌抗药性管理

　　关于灰霉病的生物防治有大量研究报道，国内外已筛选出多种抗灰霉病的有益微生物，但大多数直接使用菌株或菌剂防治病害，易受环境因素限制。因此，防治效果不稳定，不能广泛应用于生产实践。如何合理使用化学杀菌剂仍然是灰霉病有效防控的主要议题。无论是化学合成，还是天然杀菌剂，首先要严格按照生产厂家推荐的方法和剂量使用。其次将无交互抗性或负交互抗性药剂混配，由于混剂是基于对病原菌的重复杀灭，因此双方都应充分有效地针对当地的灰葡萄孢属种群。此外，应加强抗药性监测，在出现抗药性的情况下，不同季节限制使用一种杀菌剂，且不同作用方式的杀菌剂交替使用，可以降低抗性菌株的频率或延缓抗药菌株的出现。

　　抗性管理需要传统生物测定与分子技术相结合。分子技术在抗性机制研究、检测和量化灰霉病病菌抗性种群方面具有重要作用。随着分子生物学技术的进步，有望实现抗性菌株的田间快速诊断，可在低抗性频率的情况下，方便快速地检测抗药性，为田间用药提供指导。抗药性治理在于综合运用农业防治、抗性基因和天然抗菌产物，以摆脱灰霉病病菌对化学防治的过度依赖，从根源上解决抗药性问题。     （来源：《中国植保导刊》2020年第4期）